生物多样性
是人类赖以生存的物质基础
多种多样的生物
是人类共同拥有的宝贵财富
开展生物多样性宣传教育
则需要从孩童抓起
为迎接 《生物多样性公约》第十五次缔约方大会（COP15）的举办， 2019年—2020年市生态环境局、市教育委员会、共青团重庆市委员会组织开展了青少年生物多样性探究大赛（重庆）。
重庆赛区累计收到来自全市7000份作品，共有410所学校参加。大赛最终评审出特等奖 6 名、一等奖 15 名、二等奖 30 名、三等奖 60 名、优秀奖 120 名，同时还评选出了 45 所学校获得优秀组织奖。
渝小环带大家欣赏这些
饱含科学精神与自然情怀的获奖作品
和孩子们一起沉浸在多样的大自然
共同热爱生物多样性
热爱自然、热爱生活
积极投身到保护生物多样性的队伍中去
利用叶绿体DNA分子标记鉴定落羽杉、墨杉和池杉——以分子生物学研学体验思考生物物种多样性保护
作者： 徐邹明朗
指导老师：敖永权、王晓辉
学校：重庆市第十一中学校
摘要
本文利用中科院南京植物研究所提供给我校高中生国科大班的一次宝贵的研学体验机会，通过利用叶绿体DNA分子标记鉴定落羽杉、墨杉和池杉树种，并最终通过观察胶图得出了如何通过电泳谱带鉴定落羽杉属的三个树种。由此引发个人的对保护生物多样性的思考。
关键词
DNA分子标记鉴定 落羽杉属 生物多样性保护
引 言
随着生物多样性保护的愈发迫切和各种杂交培育良种、分析濒危物种遗传关系信息的工作需要，高效而准确的DNA分子鉴定技术被广泛地运用。本文通过利用叶绿体DNA分子标记鉴定落羽杉、墨杉和池杉树种的实验背景和项目意义为切口，简要介绍了其实验流程及相关步骤的说明，并最终通过观察胶图得出了如何通过电泳谱带鉴定落羽杉属的三个树种。最后针对DNA分子鉴定技术本身发展方向以及如何在生物多样性保护领域发挥更广泛作用、产生更深远影响做出了自己的合理思考并加以信息的搜寻补充，期望能通过这种方式使自己对DNA分子标记鉴定技术有更深入全面的认识并为生物多样性保护工作提供更多新鲜的方案和想法。
01
发现问题及项目意义
（一）实验背景
落羽杉属为杉科落叶或半常绿性乔木，本属有3个种，分别是落羽杉、池杉和墨西哥落羽杉(简称墨杉)，具有生长快、干型直、材质好和适应性广的特点，是林业和园林建设中很有发展前景的树种。我国江苏省·中国科学院植物研究所早在1973年起，就开始展开落羽杉属种的间杂交优势利用研究，截止2011年，育成了具有速生、耐水湿、耐盐碱、树形挺拔、主干通直圆满,抗风力强,适应性广,景观价值高等优良特性的中山杉302、中山杉118、中山杉405、中山杉406、中山杉407等一批国家级林木良种，均在林业生产中获得大面积推广，同时也为落羽杉属优良品种遗传多样性及保护生物多样性的保护方面发挥重要作用。
（二）研究意义
在像这样培育新型杂交良种的育种工作中，实验次数多、研究对象广是其研究的特点之一，如何快速、广泛、准确地鉴定树木品种成为研究过程地一个关键。
DNA分子遗传标记技术具有微量,快速,特异性强,准确可靠,对样本要求较低的特点。区别于传统上主要依靠叶型，物候期等表型特征区分落羽杉属三个树种，利用叶绿体DNA分子标记鉴别法更加简便、准确、高效，极为有效地提高了实验育种效率，保障了实验结果的准确性和科学性。
02
实验方案及部分步骤说明
（一） 研磨
研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全.提取的DNA量变少.影响实验结果。在此期间将Buffer P1加热到65℃。
（二） 加入加入Buffer P1和RNase A
Buffer P1的作用是除去RNA，RNase A中文名是核酸内切酶，作用是降解RNA，加入这两种试剂都是为了使提取的DNA内没有残留的RNA。加入试剂后涡旋混匀1min，室温放置10min。
（三） 加入Buffer P2
Buffer P2的作用是裂解细胞 ，防止DNA释放不完全。加入试剂后差速离心3min，用移液枪吸取上清液后再离心1min。
（四） Buffer P3
Buffer P3的作用是沉淀DNA。加入试剂后轻柔涡旋，涡旋结束加入吸附柱后离心1min，离心结束丢弃废液。
注：吸附柱的作用是去除DNA中蛋白、多糖、多酚等杂质。
（五） 加入漂洗液WB
加入漂洗液后差速离心1min，离心结束丢弃废液。
（六） 二次加入漂洗液WB
加入漂洗液后差速离心1min，离心结束将吸附柱放回空收集管，差速离心5min。离心结束丢弃废液，将吸附柱放入离心管。
（七） 加入去离子水
加入70ml无水乙醇加30ml的去离子水，目的在于除去盐离子。
（八） PCR扩增
PCR是聚合酶链式反应的简称，包括高温变性、低温退火、适温延伸三个步骤。进行PCR扩增后，加入loading Buffer，进行琼脂糖凝胶电泳。
（九） PCR产物检测
注：研究团队总共进行两次实验。第一次实验由于实验期间正值夏季，采摘实验材料时未考虑材料新鲜问题，采摘叶片不新鲜（成熟），导致DNA样品不纯，PCR产物检测结果并不理想。第二次实验改选了新鲜（幼嫩）的叶片，PCR产物检测结果十分成功。
（十）观察胶图及结果分析
03
观察胶图及结果分析
（一）胶图观察
1. 电泳谱带移动距离。
DNA分子越小电泳谱带移动距离越大，DNA分子越大电泳谱带移动距离越小。通过对胶图的观察发现：池杉DNA的电泳谱带移动距离最大，墨杉DNA的电泳谱带移动距离次之，落羽杉DNA的电泳谱带移动距离最小。
注：落羽杉和墨杉的DNA电泳谱带移动距离相差十分相近。
2.电泳谱带的光度
电泳谱带光度强的表示其DNA浓度大，电泳谱带光度弱的表示其DNA浓度小。在我们的实验中得到的电泳结果显示池杉的DNA浓度最大，其电泳谱带光度明显强于另外两个树种的DNA电泳谱带。
（二） 结论
叶绿体DNA分子标记鉴定落羽杉、墨杉和池杉，主要通过观察最后的电泳结果即胶图上电泳谱带的移动距离和光度强度。一般情况下，池杉DNA的电泳谱带移动距离最大，墨杉DNA的电泳谱移动距离稍大于落羽杉DNA的电泳谱带移动距离，而电泳谱图的光度强度受到实验选取材料的影响，不能作为鉴别三个落雨杉属品种的依据。
04
思考与延伸
（一）关于DNA分子标记鉴定技术
通过实验，DNA标记鉴定的高效性和准确性给我留下的印象极深。这难免不让我产生联想：树木品种通过传统的叶片形状、树干特点进行品种鉴定极易出错误判；人类与疾病鉴定间不也同样存在着这个问题吗？传统医生通过患者的表面症状容易出现误诊拖延治疗的最佳时机，尤其针对新型疾病的出现即使有现代医学设备的检查，误诊现象仍然频出。DNA标记鉴定法是否可以运用到鉴定人类疾病或者为鉴定人类疾病新途径提供思路？
上网搜寻，发现实践证明基因芯片技术也可用于核酸突变的检测及基因组多态性的分析。将生物传感器与芯片技术相结合，通过改变探针阵列区域的电场强度已经证明可以检测到基因的单碱基突变。
当然这可能只是一个并不成熟的联想，恳请前辈指正。
（二）关于生物多样性的保护
生物多样性保护三个水平包括遗传多样性、物种多样性和生态系统多样性。遗传多样性被认为是降低群体灭绝可能性和确保受威胁物种幸存的最关键因素。DNA标记鉴定法在保护生物遗传多样性方面应不仅仅局限于优良品种的育选，更应该被广泛的运用到濒危物种上。
经过上网查询，发现一种名为微卫星DNA标记技术已经运用于蚌科生物多样性的保护中。蚌科动物作为世界上最濒危的动物类群之一，对该类生物多样性保护是迫切而有意义的，而在微卫星分子标记中，模板DNA的要求较低，因此有时部分降解的DNA都可以进行有效的分析，因而增加了微卫星分析在生物多样性研究中的运用，特别是对那些濒危动物遗传关系信息的分析都是极为有效的。
参考文献
[1] 欧阳解秀，吴小平，欧阳珊，李绍波，微卫星DNA标记在蚌科生物多样性保护中的应用.
[2]於朝广，殷云龙，徐建华，落羽杉属4个新品种.2011.
[3] 邢少辰，Clarke Liu Jihong．叶绿体基因组研究进展［J］．
生物化学与生物理进展，2008，35( 1) : 21-28．
[4] 张录霞, 甘中祥, 李倍金, 魏强, 闫德林, 张勇, 迟庆勇, 彭刚,2016, 利用 InDel 标记鉴定加工番茄杂交种纯度, 分子植物育种, 14(6): 1533-1537.
[5] 齐星, 郭耀武. DNA分子标记在中药鉴定中的应用[C]// 中华中医药学会第十届中药鉴定学术会议暨WHO中药材鉴定方法和技术研讨会论文集. 2010.
